Dalam studi terbaru yang dipublikasikan di Cell, para peneliti menggunakan pencitraan multipleks dan tiga dimensi dengan pembelajaran berbasis mesin dan statistik spasial untuk melakukan penilaian molekuler dan morfologi kanker kolorektal (CRC).
Studi: Atlas 3D multipleks dari transisi keadaan dan interaksi kekebalan pada kanker kolorektal. Kredit Gambar: Gambar Anatomi/Shutterstock
Tumor padat, pada stadium lanjut, adalah asimilasi sel tumor, sel stroma, dan sel imunologi yang rumit dengan variasi histomorfologis yang cukup besar di dalam tumor. Analisis histopatologis konvensional memberikan data yang tidak memadai untuk pengobatan presisi dan studi mekanistik. Atlas tumor spasial dapat dibangun di atas fondasi histologis dan genetika tumor kontemporer dengan memperoleh data morfologis dan molekuler tiga dimensi yang mendalam.
Tentang penelitian
Dalam penelitian ini, para peneliti melakukan analisis pencitraan jaringan tiga dimensi yang sangat bermultipleks untuk membangun atlas CRC yang menyediakan data pada resolusi subselular.
Gambar tersegmentasi, dan intensitas fluoresensinya dikuantifikasi untuk menghasilkan data pada tingkat sel tunggal pada tipe seluler, keadaan, dan interaksi sel-sel. Rekonstruksi tiga dimensi dari bagian jaringan serial disiapkan dan diawasi oleh pembelajaran mesin. Dua pendekatan digunakan untuk menganalisis sel tumor, yaitu pendekatan ‘bottom-up’ dan pendekatan ‘top-down’.
Pendekatan ‘dari bawah ke atas’ melibatkan penggunaan statistik spasial untuk menghitung jenis sel, menilai interaksi seluler, dan menghasilkan lingkungan lokal, memanfaatkan alat yang digunakan dalam analisis sel tunggal seperti sitometri massa dan sekuensing asam ribonukleat sel tunggal (scRNA-seq). Sebaliknya, pendekatan ‘top-down’ melibatkan anotasi fitur histologis atau histotipe yang terkait dengan keadaan penyakit atau hasil, diikuti oleh perhitungan data multipleks untuk mengidentifikasi pola yang mendasari pada tingkat molekuler.
Analisis imunofluoresensi siklik kompleks tinggi (CyCIF) dan gambar CRC bernoda hematoksilin dan eosin (H&E) yang diperoleh dengan analisis histopatologis digabungkan dengan analisis scRNA-seq dan analisis transkriptomik mikroregion. Selanjutnya, gambar CyCIF dianalisis dengan t-SNE (penyematan tetangga stokastik terdistribusi t) dan mikroregion transkriptomik dianalisis dengan PCA (analisis komponen utama). Selain itu, analisis microarray jaringan virtual (vTMA) dilakukan.
Hasil
Analisis multipleks menunjukkan morfologi tumor yang bercampur dan gradien molekuler. Berbagai fitur seluler karakteristik kanker diamati sebagai struktur besar yang saling berhubungan. Jaringan TLS (struktur limfoid tersier) tiga dimensi menunjukkan variasi pola intra-TLS. Interaksi PD1 (protein kematian sel terprogram 1) -PDL1 (ligan kematian terprogram-1) diamati terutama antara limfosit T dan sel myeloid dalam kohort kanker kolorektal.
Analisis menunjukkan transisi yang terjadi berulang antara morfologi tumor, beberapa di antaranya bertepatan dengan gradien yang luas dalam regulator epigenetik dan ekspresi onkogen. Pada margin invasif tumor, tempat persaingan antara sel kanker, sel normal, dan sel imunologi, jumlah limfosit T berkurang, melibatkan beberapa jenis sel. Rupanya karakteristik CRC dua dimensi arketipe lokal seperti TLS ditemukan saling berhubungan dengan gradien molekuler dan jauh lebih besar dalam analisis tiga dimensi.
Lingkungan mikro tumor (TME) menunjukkan organisasi spasial yang mencakup lebih dari tiga hingga empat kali lipat. Margin invasif tumor menunjukkan margin invasif tipe pemula, margin invasif berlendir, dan margin invasif tipe dorong yang sangat dalam, memperluas tumor ke jaringan ikat yang mendasarinya dan otot polos. Segmentasi seluler pada 75 gambar WSI menunjukkan bahwa sel CK+ (positif sitokeratin) dari epitel normal dan tumor dipisahkan dari kelompok sel diferensiasi 31+ (CD31+) dari endotelium, terutama pembuluh darah, sel stroma desmin-positif, dan sel imunologi CD45-positif.
Sel-sel imunologis yang diamati dalam tumor terdiri dari CD8+ dan protein kematian sel terprogram limfosit T tipe sitotoksik yang mengekspresikan 1, limfosit T tipe penolong yang mengekspresikan CD4, makrofag yang mengekspresikan CD68 dan / atau makrofag yang mengekspresikan CD163, dan limfosit B yang mengekspresikan CD20. Selain itu, subkategori seperti CD4+ FOXP3+ Treg (limfosit T regulator) diamati. Adenokarsinoma padat menunjukkan persentase terbesar sel kanker sitokeratin-positif (70,0%), sedangkan jaringan epitel normal yang berdekatan memiliki sel sitokeratin-positif paling sedikit (25,0%) dan menunjukkan kelimpahan sel imun dan sel stroma.
Pada kanker kolorektal (CRC) 1 hingga 17, panjang korelasi yang diamati berkisar antara 80,0 mm untuk gugus diferensiasi 31 positif dan 400,0 mm untuk positif CD20 atau keratin. Panjangnya dikaitkan dengan karakteristik histomorfologi berulang, termasuk kapiler berukuran kecil di antara kelompok sel diferensiasi 31-positif, lembaran tumor untuk jenis sel sitokeratin-positif, dan struktur limfoid tersier untuk kelompok sel 20-sel positif.
Skor TMA virtual dan TMA nyata sebanding, dan temuan CyCIF cocok dengan data teoretis. Sejalan dengan pemodelan kNN yang diklasifikasikan dari data analisis CyCIF, transisi bertingkat diamati dari histologi mucinous / kelenjar tingkat rendah ke tingkat tinggi yang bertunas / terfragmentasi di antara kompartemen jaringan tumor / epitel dan imunologi / stroma. Penanda CyCIF menunjukkan intensitas bertingkat dalam seluruh tumor atau bertepatan dengan gradien morfologi lokal.
Temuan menunjukkan bahwa transisi seperti epitel-mesenkim dan TB pada CRC1 ditandai dengan pembentukan struktur fibrilar besar yang muncul sebagai tunas berukuran kecil pada penampang melintang di ujung distal. Fibril dapat menyerang lingkungan yang berbeda, termasuk musin dan stroma, yang tampaknya terbentuk oleh gangguan bertahap dari adhesi seluler terkait dengan transisi seperti epitel-mesenkimal bertingkat. Tim mengamati proliferasi tumor yang lebih sedikit pada tunas dan proliferasi yang lebih besar pada margin tumor invasif yang dalam, dengan tingkat aktivasi jalur fosfotirosin yang berbeda, dan penekanan imunologis.
Secara keseluruhan, temuan penelitian menunjukkan bahwa analisis WSI multipleks mencirikan karakteristik molekul dan morfologis bertingkat dan campuran dalam spesimen CRC manusia, menyoroti karakteristik struktural berukuran besar dan khas serta variasi intra-TLS dalam pola spasial tumor.